سنجش پروتئین

پروتئین‎ها از مهمترین ترکیبات آلی موجود در ساختار سلول‎ها و بافت‎ها هستند که درمحدوده وزنی چند هزار (برخی هورمون‎های پروتئینی) تا چند میلیون (برخی پروتئین‎های عضلات) دالتون قرار دارند. برای ساخت همه اشکال محلول و نامحلول پروتئین، زیرمجموعه‎ای از 20 نوع اسید آمینه استفاده می‎شود. کربن، اکسیژن، نیتروژن و هیدروژن عناصر مشترک در ساختمان همه اسیدهای آمینه هستند که بطور میانگین، به ترتیب 53، 23، 16 و 7 درصد وزن پروتئین‎ را به خود اختصاص می‎دهند. عناصری مانند گوگرد یا فسفر که در ساختمان برخی اسیدهای آمینه دیده می‎شوند، کمتر از یک درصد وزن پروتئین را به خود اختصاص می‎دهند.

با توجه به اهمیت جداسازی و یا کاربرد پروتئین در کلیه رشته‎های علوم زیستی بویژه علوم بیوشیمی، شیمی پروتئین، زیست شناسی سلولی و مولکولی، بیوتکنولوژی، علوم آزمایشگاهی، علوم دامی، علوم گیاهی، تغذیه و صنایع غذایی، داشتن اطلاعات  کافی از میزان یا غلظت پروتئین در واحد وزن یا واحد حجم ماده اهمیت دارد و در این راستا اهمیت انتخاب روش مناسب سنجش پروتئین کاملاً روشن است. برای مثال، هنگامی که میزان پروتئین موجود در آرد گندم برای تولید ماکارونی، یا غلظت پروتئین در مراحل مختلف تخلیص یک پروتئین دارویی از پلاسما اندازه‎گیری میشود، بسته به شرایط و هدف کار، نوع فرآورده مورد آزمون  و دقت مورد نیاز، روش مناسبی برای تعیین مقدار یا غلظت پروتئین مدنظر قرار می‎گیرد. از آنجا که اغلب پروتئین‎های دانه گندم در حلال‎های آبی نامحلول هستند، امکان انتخاب روش اندازه‎گیری پروتئین محدودتر از اندازه‎گیری پروتئین‎های پلاسما است که در حلال‎های آبی محلول هستند. با توجه به تفاوت شرایط دو مثال فوق، انتخاب روش “کجلدال” گزینه مرسوم و مناسبی برای تعیین مقدار پروتئین در آرد گندم است. در مقابل، برای اندازه‎گیری پروتئین در پلاسما معمولاً از انواعی از روش‎های رنگ‎سنجی متداول همچون روش “لوری” یا روش “برادفورد” می‎توان استفاده نمود. در این مجال، سعی می‎شود اطلاعاتی کلی در مورد روش‎های متداول سنجش پروتئین، تناسب روش‎ها برای اندازه‎گیری پروتئین در نمونه‎های مختلف و نقاط قوت و ضعف آنها، به نظر خوانندگان برسد. در ابتدا، ذکر این نکته ضروری است که این روش‎ها بطور معمول برای اندازه‎گیری همه انواع پروتئین (پروتئین تام) در یک نمونه زیستی مانند یک نوع دانه، عصاره یک نوع گیاه یا یک مایع زیستی بکار می‎‎روند و با آنها نمی توان میزان یک پروتئین مورد نظر را اندازه‎گیری نمود، مگر در مواردی که پروتئین خالص است یا درجه خلوص بالایی دارد. اندازه‎گیری میزان یا غلظت یک پروتئین خاص، نیازمند یک روش مناسب اختصاصی مانند انواعی از روش‎های فعالیت سنجی، بیوشیمی یا ایمونوشیمی است  که توضیحات آنها هدف بحث حاضر نیست.

روش کجلدال (یا کلدال) از قدیمی‎ترین (1883) روش‎های تعیین مقدار پروتئین است که مبنای اندازه‎گیری آن، میزان نیتروژن موجود در مواد آلی از جمله پروتئین‎ها است. عنصر نیتروژن، غیر از اسیدهای آمینه، در ساختار برخی ترکیبات آلی دیگر نیز وجود دارد. بدین لحاظ، درصد نسبی این ترکیبات غیرپروتئینی می تواند به همان نسبت باعث انحراف در تعیین مقدار پروتئین به روش کجلدال گردد. در شکل اولیه یا اشکال تغییر یافته روش کجلدال، ابتدا نمونه در اسید سولفوریک با کمک حرارت بالا (300 درجه سانتیگراد یا بالاتر) و کاتالیزورهای فلزی بطور کامل تجزیه و نیتروژن موجود در نمونه، به سولفات آمونیوم تبدیل می‎گردد. در مرحله بعد که به مرحله “تقطیر” معروف است، نیتروژن موجود در سولفات آمونیم در واکنش با هیدروکسید سدیم و اسید بوریک، به بورات آمونیوم تبدیل می‎شود. تیتراسیون بورات آمونیوم با اسید کلریدریک رقیق مبنای تعیین میزان نیتروژن و تخمین پروتئین (معمولاً به درصد) در این روش است. از آنجا که محتوای نیتروژن ماده آلی مبنای اندازه‎گیری در روش کجلدال است، حلالیت یا عدم حلالیت پروتئین محدودیتی برای این روش محسوب نمی‎ شود. بدین لحاظ به عنوان یک روش مرجع برای تعیین مقدار پروتئین در مواد غذایی و حتی محلول‎های زیستی قابل استفاده است. وجود عنصر نیتروژن در سایر مواد آلی غیرپروتئینی همچون اسیدهای نوکلئیک، برخی قندها، برخی چربی‎ها و حتی برخی افزودنی‎ها به مواد غذایی از عوامل مداخله‎گر در روش کجلدال است. بعلاوه، طولانی بودن روش، تولید گازهای سمی ناشی از واکنش موادی مانند اسید سولفوریک، نیاز واکنش به درجه حرارت‎های بالا و هدر رفتن نمونه پروتئین (بخصوص در صورت ارزشمند بودن نمونه) از دیگر محدودیت‎های این روش محسوب می‎شود.

برای انداره‎گیری غلظت پروتئین در محلول، چندین روش رنگ سنجی یا اسپکتروفتومتری در محدوده نور ماورای بنفش (UV) و نور مرئی ابداع شده است. جذب ذاتی پروتئین در محدوده نور ماورای بنفش  و چهار روش رنگ‎سنجی در محدوده نور مرئی شامل روش بیوره (Biuret assay)، روش لوری  (Lowry assay)، روش اسید بیسین کونینیک (bicinchoninic acid assay)  و روش برادفورد (Bradford assay) از شناخته‎ترین این روش‎ها هستند که به اختصار توضیحاتی در مورد اساس رنگ‎سنجی، حساسیت و نقاط ضعف و قوت آنها خواهد آمد. روش‎های اندازه‎گیری پروتئین با مواد فلورسانس همچون برموکرزول سبز از روش‎های جدیدتر اندازه‎گیری پروتئین است که در این مجال به آنها پرداخته نمی‎شود.

نور ماورای بنفش، به بخشی از طیف الکترومغناطیس در محدوده طول موج‎های 10 تا 400 نانومتر اطلاق می‎شود. این محدوده که در حدفاصل اشعه ایکس و نور مرئی قرار دارد، خود به مناطق “بسیار دور” (نزدیک اشعه ایکس)، “دور” (100 تا 200 نانومتر)، “حدوسط” (200 تا 300 نانومتر) و “نزدیک” (نزدیک نور مرئی) تقسیم می‎شود. با توجه به رفتار ذاتی پروتئین‎ها در برابر نور ماورای بنفش از یک طرف و دقت اسپکتروفتومترهای آزمایشگاهی در تولید و خوانش طول موج‎های نور ماورای بنفش از طرف دیگر، جذب نور ماورای بنفش در محدوده 200 تا 300 نانومتر برای اندازه‎گیری غلظت پروتئین قابل استفاده است. پیوندهای پپتیدی موجود در ساختار پروتئین‎ها قابلیت زیادی در جذب نور ماورای بنفش در محدوده 190 تا 210 نانومتر دارند. بدان معنی که اصطلاحاً “ضریب خاموشی” یا “ضریب جذب مولی” آنها در این طول موج‎ها بسیار بالا است.  برای مثال، محلول با غلظت یک میلی‎گرم در میلی‎لیتر اغلب پروتئین‎ها جذبی معادل 35-30 واحد در طول موج 205 نانومتر یا جذبی معادل 24-20 واحد در طول موج‎ 210 نانومتر دارد. برغم این ضریب خاموشی بالا، اندازه‎گیری غلظت پروتئین در این محدوده چندان عملی نیست. این محدودیت، از یک طرف ناشی از قابلیت جذب بالای برخی بنیان‎های اسیدهای آمینه (همچون متیونین، تریپتوفان، هیستدین، سیستئین، آرجینین)، انواعی از ترکیبات بافری، کوفاکتورها، لیپوپلی‎ساکاریدها، دترجنت‎ها و انواعی از متابولیت های ثانویه، و از طرف دیگر ناشی از عدم دقت اسپکتروفتومترهای آزمایشگاهی در این طول موج‎ها است.

جذب ذاتی پروتئین‎ها در محدوده 280-270 نانومتر عمدتا به دلیل حضور بنیان دو اسید آمینه تریپتوفان و تیروزین و به میزان بسیار کمتر به دلیل وجود فنیل آلانین و پیوندهای دی‎سولفیدی (سیستین) در ساختمان پروتئین است. بنابراین، از نظر تئوری ضریب خاموشی مولی پروتئین در طول موج 280 نانومتر تابع فرمول زیر است (Y، Wو C به ترتیب اختصار تریپتوفان، تیروزین و سیستین).

ε = (nW×5500) + (nY×1490) + (nC×125)

با توجه به توضیحات فوق، میزان جذب محلول پروتئین در طول موج 280 نانومتر، یکی از روشهای سریع و عملی اندازه گیری پروتئین است. از آنجا که در اغلب محلولهای پروتئین، اسیدهای نوکلئیک هم به‎میزان کم یا زیاد وجود دارد، ابتدا جذب محلول در دو طول موج 260 و 280 نانومتر قرائت می‎شود. سپس با قرار دادن نتایج در معادله زیر، غلظت پروتئین برحسب میلی‎گرم در میلی‎لیتر بدست می آید(روش واربورگ-کریستین). محاسبه جذب محلول در طول موج 260 نانومتر به خاطر به حداقل رساندن  اختلال ناشی از وجود اسیدهای نوکلئیک در محلول است.

Protein (mg/ml) = 1.55 (A280) – 0.76 (A260)

با توجه به محتوای متفاوت انواع پروتئینها از نظر وجود تریپتوفان و تیروزین، محلول با غلظت یک میلی‎گرم در میلی‎لیتر پروتئین‎های مختلف ممکن است جذبی از صفر تا 4 واحد در طول موج 280 نانومتر داشته باشند. این موضوع می‎تواند منشا خطای بزرگی در محاسبه غلظت پروتئین هایی شود که محتوای تریپتوفان و یا تیروزین آنها بسیار کم (مانند کلاژن) یا بسیار زیاد (مانند برخی پروتئین‎های مشتق از پشم) است.

در حالتی که محلول مورد آزمایش حاوی یک نوع پروتئین  با درجه خلوص بالا (مثلا بیش از 90 درصد) یا خالص است، با قرائت جذب محلول در 280 نانومتر و اطلاع از ضریب خاموشی پروتئین (ضریب جذب درصد یا مولی در همان طول موج) می‎توان غلظت دقیق پروتئین را محاسبه نمود (طبق معادله پایین). این معادله که همان قانون بیر_لامبرت در رنگ‎سنجی است، در محدوده خطی (y=ax) نتایج قابل اعتمادی دارد. l، c و εدر این معادله به ترتیب اختصار طول مسیر عبور نور (یک سانتی‎متر)، غلظت پروتئین (مولار) و ضریب جذب مولی است.

 A (absorbance) = εcl

بطورکلی، سنجش پروتئین به روش جذب در نور ماورای بنفش، روشی سریع، ساده و کم هزینه است و به معرف خاصی نیاز ندارد. بعلاوه، پروتئین در این روش از دست نمی رود. با این حال، اختلال ناشی از وجود انواعی از ترکیبات غیرپروتئینی، عدم تشابه انواع پروتئین‎ها از نظر محتوای اسیدهای آمینه و تفاوت ساختار سه‎بعدی انواع پروتئین‎ها از محدودیت‎های این روش محسوب می‎شود. بعلاوه، این روش برای اندازه‎گیری سوسپانسیون‎های پروتئینی (همچون شیر) قابل استفاده نیست.

همانگونه که در توضیحات صفحه قبل آمد، چهار روش بیوره (Biuret assay)، لوری  (Lowry assay)، اسید بیسین کونینیک (bicinchoninic acid assay) و برادفورد (Bradford assay) از شناخته‎ترین روش‎های سنجش پروتئین در محدوده نور مرئی هستند. اساس رنگ‎آمیزی پروتئین در سه روش بیوره، لوری و اسید بیسین کونینیک اتصال یون مس دوظرفیتی به پروتئین و احیای آن به یون مس یک ظرفیتی توسط باندهای پپتیدی است. در روش بیوره با اتصال یون مس به پروتئین تحت شرایط قلیایی شدید، کمپلکس بنفش رنگی تولید می‎شود. این واکنش رنگی متاثر از نوع اسیدهای آمینه سازنده پروتئین نیست، ولی وجود بافر تریس، یون آمونیوم، ساکارز، آمین های نوع اول و گلیسرول از عوامل مزاحم سنجش هستند. شکل اولیه روش بیوره که قدیمی‎تر از سایر روش‎ها است، حساسیت پایینی دارد و کاربرد آن محدود است. اشکال اصلاح‎شده این روش، حساس‎تر شده و کاربرد بیشتری پیدا نموده‎اند.

روش لوری در سال 1951 میلادی معرفی گردید. این روش شکل تغییر‎یافته‎ای از روش بیوره است که حساسیت آن با افزودن واکنش مرحله دوم توسط معرف فنل فولین (معرف فولین-سیکالتو) تقویت شده‎است. در شکل مرسوم این روش، ابتدا معرف لوری (مخلوطی از سه نوع محلول با نسبت‎های حجمی خاص) به لوله‎های حاوی نمونه و پروتئین استاندارد (آلبومین گاوی) اضافه می‎شود. در مرحله بعد، پس از افزودن معرف فولین به لوله‎ها و انکوباسیون، جذب در طول موج 600-595 نانومتر قرائت و غلظت پروتئین براساس منحنی استاندارد محاسبه می‎شود. انواعی از دترجنت‎ها (مانند تریتون X-100 و NP-40)، عوامل احیاکننده (مانند 2-مرکاپتواتانل و دی تیوتریتول)، عوامل کیلات (مانند EDTA، سیترات و EGTA)، بافرهای آمین‎دار و انواعی از ترکیبات فنلی گیاهی از عوامل مداخله‎گر در روش لوری هستند. برغم متعارف بودن روش لوری در گذشته، امروزه مقبولیت و کاربرد این روش کمتر شده است.

روش اسید بیسین کونینیک (BCA) در سال 1985 توسط اسمیت و همکاران ارائه گردید. این روش، شکل تغییریافته‎ای از روش لوری است. در این روش، اسید بیسین کونینیک به عنوان جایگزین معرف فولین-سیکالتو، با یون‎های مس متصل شده به باندهای پپتدی در شرایط قلیایی، واکنش می‎دهد و کمپلکس بنفش رنگی در انتهای واکنش ایجاد می‎کند. در شکل فعلی این روش، تنها از یک معرف (معرف کاری استاندارد) استفاده می‎شود.حجم مورد نیاز این معرف قبل از انجام آزمایش، از مخلوط نمودن دو محلول پیش‎ساز تهیه می‎شود. پس از افزودن معرف به لوله‎ها (نمونه‎ها و استاندارد) و انکوسیون 30 دقیقه‎ای در دمای 60 درجه سانتیگراد، جذب نمونه‎ها پس از خنک شدن، در طول موج 562 نانومتر قرائت می‎شود. ظهور رنگ در این روش متاثر از pH، درجه حرارت و زمان واکنش است. بدین لحاظ انجام واکنش در دمای 60 درجه سانتیگراد باعث تولید حداکثر رنگ در کمترین زمان انکوباسیون می‎شود. ترکیبات کیلات (با برداشتن یون‎های مس)، قندهای احیاکننده (همچون فروکتوز، گلوکز یا لاکتوز)، آب اکسیژنه، انواعی از بافرهای زویتریونی، مواد احیاکننده (همچون 2-مرکاپتواتانل و دی تیوتریتول)، برخی دترجنت‎ها (مانند توین 20 و توین 80)، آمینهای بیولوژیک (مانند کتکول‎آمین، دوپامین و آدرنالین) و برخی آنتی بیوتیک‎ها (همچون پنی‎سیلین) از عوامل مداخله‎گر در سنجش پروتئین به روش BCA هستند. بطورکلی، روش BCA برغم متاثر بودن از عوامل مداخله‎گر فوق، به دلیل حساسیت بالا و کوتاهتر شدن زمان به دلیل یک مرحله‎ای شدن آزمایش،از روشهای مقبول و پر استفاده در میان روشهای اندازه‎گیری پروتئین است. بعلاوه نشان داده‎اند که این روش گزینه مناسبی برای اندازه‎گیری پروتئین‎های  رسوب نموده (همچون پروتئین‎های رسوب داده شده ادرار) یا پروتئین‎های موجود در سلولهای چسبیده به سطوح است.

روش برادفورد در سال 1967 میلادی معرفی شد. اساس اندازه‎گیری پروتئین در این روش، اتصال ماده کوماسی آبی به پروتئین در شرایط اسیدی است. کوماسی آبی درخشان (Coomassie Brilliant Blue) یک ماده رنگی است که برای رنگ‎آمیزی پشم استفاده ‎شده است. این ماده در دو نوع R (سرخ فام) و G (سبز فام) قابل عرضه است. نوع R بیشتر برای رنگ‎آمیزی پروتئین در ژل الکتروفورز و نوع G بیشتر برای سنجش پروتئین استفاده می‎شود. هر مولکول کوماسی آبی در محیط اسیدی قوی، دو پروتون جذب می‎کند و محلول آن متمایل به رنگ قرمز می‎شود. با اتصال کوماسی به مولکول‎های پروتئین، پروتون‎ها آزاد می‎شوند و رنگ محلول به آبی تغییر می‎کند. ظاهراً اسیدهای آمینه لیزین و آرجینین و بخش‎های آبگریز پروتئین در اتصال به کوماسی آبی نقش دارند. سنجش پروتئین به روش برادفورد، یک روش سریع و یک مرحله‎ای است که برای انجام آن فقط یک معرف کافی است (محلول کوماسی آبی G-250 در اسید ارتوفسفوریک و اتانل). استوک معرف برادفورد را می‎توان برای مدت‎های طولانی در شرایط مناسب نگهداری نمود. از محدودیتهای عمده روش برادفورد، وابستگی آن به ترکیب اسیدهای آمینه پروتئین‎ها است. برای مثال رنگ‎پذیری آلبومین گاوی که اغلب به عنوان پروتئین استاندارد از آن استفاده می‎شود، بیش از حد طبیعی است. بعلاوه، رنگ‎پذیری ضعیف پپتیدهای کم وزن و پروتئینهای داری بخش قندی زیاد، از محدودیت های دیگر این روش است. این محدودیت ها در مواردی باعث میشود که غلظت بدست آمده با روش برادفورد بسیار متفاوت از غلظت واقعی پروتئین در مقایسه با روش کجلدال به عنوان روش مرجع باشد. در مقابل، روش برادفورد برخلاف سه روش رنگ‎سنجی قبلی، با حضور دترجنت‎هایی مانند سدیم دودسیل سولفات یا تریتون X-100  سازگار است، مگر آنکه غلظت آنها بالا باشد. حتی نشان داده‎اند که سدیم دودسیل سولفات یا تریتون X-100 در غلظت های پایین به افزایش حساسیت این روش کمک می‎کنند. انجام روش برادفورد به دو صورت “استاندارد” (معمولاً در لوله) و “حساستر” (معمولاً در میکروپلیت) امکانپذیر است. تنها تفاوت این دو صورت، نسبت حجم معرف به نمونه است که در روش استاندارد 50 برابر و در روش حساستر 10 برابر می‎باشد. حساسیت روش حساستر حدود ده برابر روش استاندارد است. بطورکلی روش برادفورد برغم محدودیت‎های مذکور، روشی سریع، ساده و حساس است که محدوده استفاده ار آن هرروز بیشتر می‎شود.

منابعی برای مطالعه بیشتر

– Sapan CV, Lundblad RL,‹Price NC. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 1999; 29: 99–108.

– Noble JE, Knight AE, Reason A J, et al. A comparison of protein quantitation assays for biopharmaceutical applications. Mol. Biotechnol. 2007; 37: 99-111.