الکتروفورز، فرآیند حرکت مولکولهای باردار در یک میدان الکتریکی است. این فرآیند به سه مولفه اصلی شامل خواص فیزیکوشیمیایی مولکول (همچون بار الکتریکی، اندازه و شکل مولکول)، شرایط محیط الکتروفورز (همچون نوع و غلظت بستر، درجه حرارت محیط، جنس، قدرت یونی و pH بافر) و خصوصیات میدان الکتریکی (همچون جریان الکتریکی، اختلاف پتانسیل، توان و زمان الکتروفورز) بستگی دارد. الکتروفورز یک ابزار کارآمد، کم هزینه، حساس و تکرارپذیر برای جداسازی ماکرومولکولها و بررسی خواص آنها است. این روش بطور معمول در یک بستر نیمه جامد مانند ژل آگارز یا پلی اکریل آمید صورت میگیرد. ساختمان اسفنجی این دو نوع ژل به نحوی است که غربال ماکرومولکولهای با اندازه متفاوت را ممکن میسازد. آگارز به دلیل بزرگی شبکه خود عمدتاً برای جداسازی ماکرومولکولهای بزرگتر مانند اسیدهای نوکلئیک مناسب است. در مقابل، پلی اکریل آمید به دلیل خواص پلیمری و شبکه ژلی خود، به طور گسترده برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک کوتاهتر و پر وتئین ها بکار میرود.
الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید را می توان برای تجزیه و تحلیل اندازه، مقدار، خلوص و نقطه ایزوالکتریک پلی پپتیدها و پروتئین ها بکار برد. بنابراین این تکنیک، ابزاری بسیار مهم در بیوشیمی، شیمی پروتئین، میکروب شناسی، ژنتیک، بیوتکنولوژی، علوم گیاهی، علوم دامی، صنایع مواد غذایی و زیست شناسی مولکولی است. در میان اشکال مختلف این تکنیک، الکتروفورز در ژل پلی آکریل آمید در حضور سدیم دودسیل سولفات (SDS) که در ابتدا توسط لاملی (Laemmli) برپایه بافر تریس- هیدروکلرید به عنوان بافر ژل و بافر تریس- گلیسین به عنوان بافر الکترودها طراحی شد، متداول‌ترین روش الکتروفورز پروتئین است. در این روش، با اتصال دترجنت آنیونی سدیم دودسیل سولفات به بخش‌های آبگریز پروتئین همچون باندهای پپتیدی، ضمن پوشاندن بارهای ذاتی مولکولهای پروتئین، تراکم بارمنفی مشابهی در آنها ایجاد میشود (تعداد بار منفی مشابه در واحد طول زنجیره پلیپپتید). تحت چنین شرایطی، حرکت الکتروفورزی انواع پروتئین‌ها در بستر ژل پلی اکریل آمید ، متناسب با اندازه پروتئین‌ها است و بار ذاتی مولکول تاثیر محسوسی در این خصوص ندارد.
در روش SDS-PAGE مونومرهای آکریل آمید و N,N’-متیلن-بیس آکریل آمید (بیس آکریل آمید) اجزای اصلی ساختار ژل پلی اکریل آمید هستند و واکنش کوپلیمریزاسیون آنها توسط رادیکال آزاد شیمیایی یا فتوشیمیایی آغاز می شود. پلیمریزاسیون شیمیایی اکریل آمید معمولاً توسط تترا متیل اتیلین دی آمین (TEMED) و پرسولفات آمونیوم تسهیل می شود. با حل شدن پرسولفات آمونیوم، رادیکال های آزاد شده پرسولفات، مونومر آکریل آمید را فعال می کند. TEMED نیز به عنوان کاتالیزور برای تسریع واکنش پلیمریزاسیون به دلیل توانایی آن در حمل الکترون اضافه می شود. مونومرهای آکریل آمید فعال شده می توانند با مونومرهای غیرفعال واکنش داده و یک زنجیره پلیمری بلند تولید کنند. زنجیره های پلیمری بلند اکریل آمید به طور تصادفی با پلهای عرضی بیس آکریل آمید به هم متصل می شوند تا شبکهای از زنجیره های پلی اکریل آمید را تشکیل دهند. بطورکلی، غلظت و خلوص مونومرها، نوع و غلظت آغازگرها، pH، درجه حرارت، انواع مواد افزودنی، اکسیژن (تماس با هوا) و شدت نور (در فتوپلیمریزاسیون) از عوامل مهم در سرعت پلیمریزاسیون، انداره منافذ و نظم شبکه ژل پلی اکریل آمید هستند.
در SDS-PAGE ژل پلی اکریل آمید شامل دو بخش بالا (ژل متراکم کننده) و پایین (ژل جدا کننده) است که از نظر اندازه منافذ و ترکیب بافری متفاوت هستند. در این روش اجزای یک نمونه پروتئینی در طی عبور از ژل بالا همگی در حدفاصل یک الکترولیت پیشرو (یون جلودار) و یک الکترولیت پسرو (یون تعقیب کننده) حرکت می کنند و هر جزء نمونه با توجه به رفتار الکتروفورزی خود به صورت یک لایه نازک متراکم میشود. به نحوی که سریعترین جزء نمونه عقبتر از یون پیشرو و کندترین جزء نمونه جلوتر از یون تعقیبکننده قرار میگیرد. با ورود پروتئین‌ها به ژل پایین (جداکننده)، با توجه به تغییر شرایط بافری و کوچک شدن منافذ ژل، حرکت همه مولکولهای پروتئین محدود میشود. هرچند این محدودیت برای مولکولهای بزرگتر بیش از مولکولهای کوچکتر است. نتیجه آنکه میزان حرکت مولکولهای پروتئین در بستر ژل در انتهای فرآیند، متناسب با اندازه آنها خواهد بود و حرکت نسبی (نسبت به رنگ نشانگر) انواع پروتئین‌ها در محدوده صفر تا یک تعریف میشود.
اصطلاح “سیستم بافری ناپیوسته” در SDS-PAGE به تفاوت ترکیب یونی و pH بافرها در مسیر الکتروفورز اطلاق میشود. الکتروفورز در جریان الکتریکی ثابت (آمپر ثابت) در این سیستم، با بالارفتن مقاومت الکتریکی و تولید گرما همراه است. زیرا ثبات جریان الکتریکی نیازمند بالارفتن اختلاف پتانسیل (ولتاژ) در طول آزمون است. اگر تحت چنین شرایطی گرمای تولیدی بیش از حد تحمل باشد، وجود سیستم خنککننده ژل ضروری است. گرما اگرچه به تسریع حرکت یونها (از جمله یونهای پروتئین) و کوتاه شدن زمان آزمایش کمک میکند، با این حال میزان زیاد آن میتواند به اختلال در فرآیند الکتروفورز، بینظمی و آسیب به ژل منتهی شود. در مقابل، الکتروفورز در اختلاف پتانسیل ثابت (ولتاژ ثابت) در سیستم بافری ناپیوسته، به تدریج با کاهش جریان الکتریکی و کاهش گرما همراه است. اگر در این حالت اختلاف پتانسیل بسیار بالا انتخاب نشود، گرمای تولیدی مشکل ساز نیست و وجود دستگاه خنککننده ضرورتی ندارد. بطورکلی باید توجه داشت که اختلاف پتانسیل و دمای محیط آزمون، دو فاکتور اصلی تعیینکننده سرعت حرکت یونهای پروتئین به سمت قطبهای مخالف هستند. شدت جریان الکتریکی، بیانگر تراکم حرکت تمام یونهای موجود در محیط الکتروفورز از جمله یونهای پروتئین است و تعیینکننده سرعت حرکت پروتئین نیست. یونهای پروتئین که در ابتدای الکتروفورز کسر بسیار کوچکی از جریان الکتریکی را به خود اختصاص میدهند، با گذشت زمان سهم بیشتری در جریان الکتریکی دارند. چرا که با گذشت زمان، بخش بیشتری از یونهای غیرپروتئینی از محیط عمل خارج میشوند.
ژل پلی اکریل آمید را میتوان به اشکال لولهای یا صفحهای به ضخامت بیشتر یا کمتر از میلیمتر ساخت. در حال حاضر ژلهای صفحهای نازک با ضخامت یک میلیمتر یا کمتر بیشترین استفاده را در الکتروفورز دارند. در SDS-PAGE صفحهای عمودی که معمولاً در ولتاژ پایین (100 تا 300 ولت) انجام میگیرد، ژل پلی اکریل آمید بین دو لایه شیشه قرار میگیرد و از بالا و پایین با مخازن بافری و الکترودها در ارتباط است. این نوع ارتباط باعث میشود تا از میدان الکتریکی اعمال شده، استفاده مطلوبی در جداسازی پروتئین صورت گیرد. این نوع ژلها را میتوان در اندازه کوچک (7× 7 سانتیمتر) یا استاندارد (14 × 14 سانتیمتر) در آزمایشگاه ساخت یا از شرکتهای تولیدکننده تهیه نمود. برای انجام الکتروفورز در ژلهای صفحهای افقی، ابتدا ژل پلی اکریل آمید در حدفاصل دو لایه شیشه یا نایلون و بدور از هوا منعقد میشود (مشابه الکتروفورز عمودی). سپس یکی از دو لایه نگهدارنده ژل جدا میشود و ژل همراه لایه نگهدارنده دیگر روی دستگاه قرار میگیرد. ژلهای افقی بسیار نازک، برای روشهای الکتروفورز در ولتاژهای بسیار بالا مانند ایزوالکتریک فوکوسینگ مناسب هستند. در این حالت، وجود سیستم خنککننده مطلوب برای جلوگیری از افزایش شدید گرما ضروری است. بطورکلی، در ژلهای صفحهای نازک چون نمونهها در شرایط همسان جداسازی میشوند، امکان مقایسه آنها راحتتر است.بعلاوه جداسازی در ژلهای صفحهای به زمان کمتری نیاز دارد و رنگآمیزی، تراکم سنجی، تصویر برداری و خشک کردن و نگهداری آنها سادهتر است.
قابلیت تفکیککنندگی بسیار بالای SDS-PAGE عمدتاً ناشی از اثر سدیم دودسیل سولفات در ایجاد بار منفی با تراکم مشابه در طول زنجیره پلیپپتید و قابلیت مطلوب ژل پلی اکریل آمید در غربال زنجیرههای پلیپپتید با اندازه مختلف است. وجود مقدار کافی سدیم دودسیل سولفات در کنار یک ماده احیاکننده (همچون 2-مرکاپتواتانل یا دی تیو تریتول) و گرما (آب جوش) باعث میشود تا کلیه اتصالات غیرکووالانی مانند اتصالات یونی، هیدروژنی و واندروالس حذف شوند، پیوندهای دیسولفیدی احیا شوند، زیرواحدهای پروتئینهای چندواحدی از همدیگر جدا گردند و ساختار زنجیرههای پلیپپتدی کاملاً باز شوند. در شرایط فوق، همه زنجیرههای پلیپپتیدی دارای بار منفی با تراکم مشابه میشوند و در دامنه وسیعی از pH به طرف آند حرکت میکنند. اگر درصد ژل پلی اکریل آمید متناسب با محدوده وزنی زنجیرههای پلیپپتیدی موجود در نمونه انتخاب گردد، میزان مهاجرت پلیپپتیدها به طرف آند متناسب با اندازه (وزن مولکولی) آنها خواهد بود. بدان معنی که هرچه اندازه زنجیره بزرگتر باشد، حرکت آن به دلیل اصطکاک بیشتر با بستر ژل، کمتر خواهد بود.
شکلی از SDS-PAGE که در آن ماده احیاکننده در بافر نمونه وجود ندارد، به SDS-PAGE غیراحیایی معروف است. در این حالت سدیم دودسیل سولفات در حضور گرما اغلب اتصالات غیرکووالان را حذف میکند و به اکثر مناطق آبگریز پروتئین متصل میشود. با این حال، عدم احیای پیوندهای دیسولفیدی باعث میشود که زیرواحدها در پروتئینهای چند زیرواحدی (واجد پیوندهای دیسولفیدی بین زنجیرهای) از همدیگر جدا نشوند و دسترسی سدیم دودسیل سولفات به بخش‌های دورنی زنجیرههای پلیپپتیدی واجد پیوندهای دیسولفیدی درون زنجیرهای محدود گردد. در چنین حالاتی تخمین وزن پروتئین متفاوت از SDS-PAGE احیایی است. برای مثال، اکتینیدین میوه کیوی (یک سیستئین پروتئاز) که متشکل از یک زنجیره پلیپپتدی واجد سه پیوند دیسولفیدی درون زنجیرهای است، در شرایط احیایی و غیراحیایی به ترتیب در موقعیتهای وزنی 29 و 23 کیلودالتون قرار میگیرد. یا ایمونوگلوبولین جی (IgG) که یک پروتئین چهار زیرواحدی متشکل از دو نوع زنجیره پلیپپتیدی واجد پیوندهای دیسولفیدی درون و بین زنجیرهای است، در شرایط غیراحیایی در موقعیت وزنی حدود 150 کیلودالتون و در شرایط احیایی در دو موقعیت وزنی 50-55 و 25-27 کیلودالتون قرار میگیرد.
SDS-PAGE متداول‌ترین روش الکتروفورز پروتئین در ژل پلی اکریل آمید برای جداسازی و مطالعه پروتئین‌ها است. با این حال، نمی‌توان از آن برای تجزیه و تحلیل کمپلکس‌های پروتئینی دست‌نخورده و پروتئین‌هایی استفاده کرد که فعالیت بیولوژیکی آنها برای آزمایش‌های فعالیت سنجی بعدی باید حفظ شود. در چنین مواقعی استفاده از روشهای دیگر که ساختمان فضایی پروتئین را دچار کمترین واسرشتگی نماید، ضروری است. محدودیت دیگر این روش، عدم توانایی آن در تفکیک زنجیرههای پلیپپتیدی با اوزان مشابه یا اوزان نزدیک یکدیگر است. در این حالت استفاده از روشهای دیگر مانند ایزوالکتریک فوکوسینگ که پروتئین‌ها را برپایه تفاوت بار الکتریکی جدا مینماید،لازم است.
برای مطالعه بیشتر:
Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach, B.D. Hames, Third edition, Oxford University Press, Oxford, 1998
راهنمایی نظری و عملی الکتروفورز پروتئین در ژل، چاپ دوم، علی مصطفایی، انتشارات یادآوران، سال 1382