سلولهای زنده حاوی صدها هزار ترکیب درشت مولکول مانند پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک، لیپیدها و ریز مولکول هستند که به عنوان واحدهای سازنده درشت مولکولها و یا به عنوان اجزای مسیرهای پیچیده متابولیک عمل می کنند. برخی از این مولکول ها فقط در مقادیر کم (واسطه ها در مکانیزم های آنزیمی) و برخی دیگر به وفور وجود دارند (پروتئین های ساختاری). مطالعه ی ترکیبات شیمیایی منفرد سلول ها می تواند به ما بینش بسیاری در مورد فرایندهای اساسی سلولی بدهد و به درک ما از پویایی ترکیب سلول و عملکرد آن کمک کند.
کروماتوگرافی یک روش پایه برای جداسازی ترکیبات موجو در یک مخلوط به هدف بررسی و مطالعه آنها است. در ابتدا، این روش توسط T. swett (1903) در جداسازی رنگدانه های گیاهی مورد استفاده قرار گرفت، اما ما اکنون می دانیم كه این روش برای انواعی از ترکیبات رنگی یا غیررنگی قابل استفاده است. به دلیل طیف وسیعی از اندازه، شکل، بار و آبگریز بودن در مولکولهای زیستی، انتظار می رود که هیچ یک از روشهای کروماتوگرافی برای جداسازی تمام ترکیبات کافی نباشد.
در یک سیستم دو فازی، یک مولکول ممکن است بین فازها تقسیم شود. سیستم های دو فازی موجود عبارتند از: سیستم مایع – مایع، سیستم جامد-مایع، سیستم جامد-گاز، سیستم مایع-گاز. در سیستم مایع – مایع ، حلالیت نسبی مولکول در هر مایع در تعیین تقسیم شدن بین فازها بسیار مهم خواهد بود. در یک سیستم جامد-مایع، ممکن است مولکولهای مختلف نمونه به درجات مختلف روی فاز جامد جذب شوند. پدیده های تقسیم شدن و جذب در سیستم ستونی امکان پذیر است و به آن کروماتوگرافی ستونی گفته می شود. در کروماتوگرافی ستونی ، یک فاز به عنوان بسترعمل می کند (فاز ثابت) در حالی که فاز دیگر (فاز متحرک) آزادانه در بستر جریان می یابد.
وقتی مخلوطی از چندین جزء به چنین سیستم دو فازی اعمال شود، هر جزء ضریب تقسیم جداگانه خود را خواهد داشت. در نتیجه، هر جزء با فاز ثابت تعامل کمی متفاوت خواهند داشت و به دلیل تقسیم بندی متفاوت بین فازها، با سرعت های مختلف از میان ستون حرکت می کنند. از آنجا که ضریب تقسیم مستقیماً تحت تأثیر شرایط دقیق آزمایشگاهی همچون دما، قطبیت حلال و … است. بنابراین، در کروماتوگرافی ستونی برای دستیابی به جداسازی کارآمد اغلب از تفاوتهای جزئی در ضریب تقسیمی که مولکولهای نمونه دارند، استفاده می شود.
در سیستم های کروماتوگرافی که در بیوشیمی استفاده می شود، فاز ساکن از ذرات جامد یا از ذرات جامد پوشیده شده با مایع تشکیل می شود. در حالت اول (ذرات جامد)، گروه های شیمیایی اغلب به صورت کووالانسی به ذرات متصل می شوند، که به این روش کروماتوگرافی مایع فاز پیوندی می گویند. در حالت دوم (ذرات جامد پوشیده شده با مایع)، یک فاز مایع ممکن است ذره را پوشانده و توسط جاذبه فیزیکی غیرکوالانسی به آن متصل شود. به این نوع سیستم کروماتوگرافی فاز مایع-مایع گفته می شود. یک مثال خوب از کروماتوگرافی فاز مایع – مایع، سیلیکا است که با یک هیدروکربن غیر قطبی پوشانده شده است. معمولاً ذرات از پلیمرهای هیدراته شده مانند سلولز یا آگارز تشکیل شده اند. چنین ذراتی در یک ستون بی حرکت و با فاز متحرک شسته می شوند. آنها برای کروماتوگرافی بیومولکول ها، خصوصیات جریان خوبی را ارائه می دهند و دارای قدرت مکانیکی کافی و از نظر واکنش های شیمیایی بی اثر هستند. از آنجا که مولکول های زیستی برای عملکرد در یک محیط آبی تکامل یافته اند، در صورت نیاز به حفظ ساختار طبیعی مولکول (به عنوان مثال در خالص سازی آنزیم های فعال)، معمولاً استفاده از بافرهای آبی به عنوان فاز متحرک ضروری است. اگر ساختار طبیعی مورد نیاز نباشد، آن موقع می توان از شرایط “غیر بیولوژیکی” بیشتری مانند حلالهای آلی استفاده کرد (به عنوان مثال در خالص سازی پپتیدها توسط کروماتوگرافی فاز معکوس).
فازهای مایع – جامد یا مایع – مایع رایج ترین سیستم های دو فازی هستند که در بیوشیمی استفاده می شوند. با این حال، در شرایط خاص ممکن است از فازهای دیگری استفاده شود. به عنوان مثال، از فازهای جامد- گاز و مایع -گاز در کروماتوگرافی گازی استفاده می شود. صرف نظر از ترکیب (اجزای) دقیق فاز، جداسازی در کروماتوگرافی نتیجه ی مستقیم مقادیر مختلف ضریب تقسیم هر یک از اجزای نمونه است.
برای به حداقل رساندن کاهش فعالیت ترکیبات آلی، جداسازی آن ها اغلب در بافرهای آبی و در دمای پایین تر از دمای اتاق انجام می شوند. درجه حرارت پایین به ویژه در کروماتوگرافی عصاره ی سلول، در طول خالص سازی پروتئین بوده و باعث کاهش فعالیت پروتئازهایی می شود که ممکن است پروتئین مورد نظر را تخریب کنند.
کروماتوگرافی مایع (Liquid Chromatography)
بطور کلی کروماتوگرافی در فاز متحرک مایع را کروماتوگرافی مایع (LC) مینامند. در کروماتوگرافی مایع، جداسازی با عبور نمونه از ستونی حاوی فاز ثابت فشرده (متراکم) انجام می شود و بافر به عنوان فاز متحرک در مخازن از طریق لوله بر روی ستون جریان می یابد. حجم و شکل ستون به مقدار نمونه ای که باید جدا شود و به روش کروماتوگرافی مورد استفاده بستگی خواهد داشت.
انواع مختلفی از کروماتوگرافی مایع برای جداسازی ترکیبات شیمیایی مختلف استفاده می شود. در حالت های کروماتوگرافی تفکیکی، نمونه با عبور از فاز ثابت به اجزای منفرد تفکیک می شود، ژل فیلتراسیون مثال مناسبی از کروماتوگرافی تفکیکی است. در کروماتوگرافی جذبی لازم است که همه یا بخشی از نمونه جذب بستر جامد می شود و بعد بخش جذب شده بصورت جزء به جزء جدا می شود. کروماتوگرافی تبادل یونی یک مثال مناسب از کروماتوگرافی جذبی است که در آن اجزای نمونه پس از بارگیری تمام نمونه و شستشوی کامل آن از میان ستون، با استفاده از یک شیب از محلول های نمکی رقیب، به صورت جزء به جزء از ستون جدا و شناسایی می شوند.
کروماتوگرافی گازی (Gas Chromatography)
بسیاری از مولکول های زیستی به دمای بالا حساس هستند و ممکن است دما منجر به تخریب ساختار و عملکرد آنها شود. با این حال، یک دسته از مولکولهای مهم در بیوشیمی می توانند به مشتقاتی تبدیل شوند که از نظر ساختاری در دامنه دمایی200-250 درجه ی سانتیگراد پایدار باشند. استرول و کربوهیدراتهای تری متیل سیلات شده (که گروههای هیدروکسیل آنها استری شده)، استرهای متیله شده اسیدهای چرب مثال های خوبی از این دسته مولکولها هستند. یک دسته دوم از مولکول ها (به عنوان مثال اتانول) نیز در دمای کمی پایین تر و بدون مشتق سازی پایدار و فرار هستند. هر دو این گروه از مولکول ها توسط کروماتوگرافی گازی (GC ، که کروماتوگرافی مایع گازی نیز نامیده می شود ، GLC) جداسازی و آنالیز می شوند.
کروماتوگرافی مایع-گاز (Gas Liquid Chromatography) نوعی کروماتوگرافی تفکیکی است که در آن یک نمونه فرار در یک فاز متحرک گاز بی اثر (گاز حامل) مانند نیتروژن، هلیم یا آرگون حمل می شود و به یک ستون باریک (قطر 0.1 تا 0.5 سانتی متر) اعمال می شود که طول آن از یک تا سی متر و حاوی یک فاز ساکن مایع است. نمونه با تزریق، از طریق سپتوم لاستیکی به درگاه تزریق، به سیستم وارد می شود. دما در درگاه تزریق تقریباً 10 درجه سانتیگراد بالاتر از دمای ستون است (برای اطمینان از فرار کارآمد). ستون در کوره ای قرار دارد که دمای بالا را حفظ می کند. کنترل دما در این کوره برای کروماتوگرافی موفق بسیار مهم است و ممکن است از شیب های دما برای دستیابی به جداسازی بهینه استفاده شود. متفاوت بودن دمای ستون، جریان گاز و نوع ستون ممکن است جداسازی GC را بهینه کند. اجزای نمونه به طور متفاوتی بین فازها تقسیم می شوند و به دلیل طولانی بودن ستون، به طور کارآمد از یکدیگر جدا می شوند. ستون ممکن است یا با ذرات جامد پوشیده شده با یک فاز مایع فشرده (متراکم) گردد یا ممکن است یک ستون مویین باشد که در آن دیواره داخلی ستون با مایع پوشانده شده است. اجزای نمونه ممکن است با استفاده از یونیزاسیون شعله، فتومتری شعله یا ردیاب های هدایت حرارتی شناسایی شوند. دما در آشکارسازها نیز تقریباً 10 درجه سانتیگراد بالاتر از دمای ستون نگه داشته می شود.
کروماتوگرافی تبادل یونی ((Ion Exchange
بار خالص سطح پروتئین ها بطور عمده ناشی از یونیزاسیون گروه های اسید و بازی زنجیره جانبی اسیدهای آمینه است که برخی از آنها دارای بار مثبت یا منفی در pH معین هستند.
در pH 7.0 اسیدهای آمینه اسیدی (اسیدهای گلوتامیک و آسپارتیک) را دارای بار منفی می کند در مقابل باقیمانده اسیدهای آمینه بازی (لیزین و آرژنین) بار مثبت پیدا می کنند. اکثر پروتئین ها در pH اسیدی دارای بارهای خالص مثبت و در pH قلیایی دارای بار خالص منفی هستند. بارهای مثبت و منفی می توانند یکدیگر را خنثی کنند، بنابراین، در یک pH خاص، پروتئین ممکن است دارای بار خالص صفر باشد، حتی اگر حاوی برخی از بارهای مثبت و منفی باشد.pH ی را که پروتئین در آن بار خالص صفر دارد، نقطه ایزوالکتریک (pI) نامیده می شود. از آنجا که توالی اسید آمینه ای هر پروتئینی منحصر بفرد است و بار سطحی، ساختار و pI پروتئین ها به توالی اسید آمینه آنها بستگی دارد.
کروماتوگرافی تبادل یونی نوعی کروماتوگرافی جذبی است که در آن پروتئین های باردار یا سایر مولکول های زیستی با یون های کوچک با بار مشابه مانند نمک ها مبادله می شوند (به عنوان مثال Na+، −Cl). این یونها که به ساختارهای شیمیایی سطح فاز ثابت متصل هستند همان گروههای تبادل یونی یا تعویض کننده های یونی نامیده می شوند. دو نوع تعویض کننده یونی رایج عبارتند از تعویض کننده های آنیونی (که یونها یا آنیونهای با بار منفی تبادل می کنند) و تعویض کننده های کاتیونی (که کاتیونهای با بار مثبت تبادل می کنند). تعویض کننده های یونی، گروه های بارداری هستند که به طیف گسترده ای از ذرات جامد مانند سلولز ، آگارز و وینیل بنزن متصل می شوند
در یک آزمایش کروماتوگرافی تبادل یونی، نمونه بر یک فاز ثابت که با یون مورد تبادل شارژ شده است، اعمال می شود (به عنوان مثال −Cl). پروتئین (و هر گونه دیگر از بارهای مشابه در نمونه) با یون (به عنوان مثال −Cl) تعویض می شود، و به تعویض کننده یونی متصل می شود. شستشوی پروتئین های متصل شده با معکوس کردن فرآیند اتصال و مبادله دوباره آنها با یون ها حاصل می شود. این کار معمولاً با استفاده از مقدار زیادی نمک (به عنوان مثال NaCl) در فاز متحرک انجام می شود. از آنجا که بار خالص پروتئین ها متفاوت است، ممکن است پروتئین ها در pH معینی با قدرت های مختلف به یک تعویض کننده یونی متصل شوند، یعنی برخی از پروتئین ها ممکن است به شدت متصل شوند در حالیکه سایر پروتئین ها ضعیف متصل شوند. می توان با استفاده از نمک در یک شیب پیوسته، از این مزیت برای جدا کردن پروتئین ها استفاده کرد. با استفاده از چنین روشی، پروتئین های ضعیف متصل شده ابتدا شسته می شوند در حالی که پروتئین های محکم متصل شده بعداً شسته می شوند.
ژل فیلتراسیون (Gel filtration chromatography)
پروتئین ها و سایر مولکول های زیستی غالباً از نظر جرم و شکل بسیار متفاوت از یکدیگر هستند. کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون (یا کروماتوگرافی غربال مولکولی (molecular sieve or size exclusion chromatography)) مولکول های زیستی از جمله پروتئین ها را به روشی که به جرم و اندازه ی آنها بستگی دارد، با حفظ ساختار، فعالیت، شکل و سایر مشخصاتشان جدا می کند.
فاز ثابت در این روش از رزین های متخلخل با دامنه اندازه منافذ مشخص و باریک تشکیل شده است. این منافذ اجازه می دهد تا فقط مولکول های کوچکتر در منافذ نفوذ کنند. این مقدار به عنوان محدوده ی نفوذ (cutoff value یا exclusion limit) فاز ثابت شناخته می شود. هنگامی که مولکول زیستی درون دانه ها قرار گرفت، به صورت لحظه ای در کانال های عبوری آن سرگردان می شود. با عبور نمونه از بستر چنین فاز ثابتی، مولکولهای کوچکتر نسبت به مولکولهای بزرگتر بیشتر حفظ می شوند و مولکولهایی با جرم بیشتر از محدوده ی نفوذ (exclusion limit) آزادانه از ستون عبور می کنند، و در void volume ، در یک پیک منفرد و جدا نشده شسته می شوند. با این حال، مولکولهای موجود در محدوده تفکیک (fractionation range) ژل به طور کلی متناسب با اندازه آنها، بیشترین زمان ماندگاری در ستون را دارند، یعنی مولکولهای کوچکتر دیرتر از ستون خارج می شوند. محدوده و قدرت تفكیك قابل دستیابی با چنین سیستم كروماتوگرافی تا حد زیادی به ترکیب و یكنواختی جمعیت رزین ها در فاز ثابت بستگی خواهد داشت.
کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون سه کاربرد اصلی در بیوشیمی دارد. از ژل فیلتراسیون می توان برای نمک زدایی یا تعویض سریع بافر با حداقل رقیق سازی نمونه پروتئینی استفاده کرد.
کاربرد دوم به این واقعیت بستگی دارد که حجم شستشوی پروتئین ها از ستون های ژل فیلتراسیون به جرم آنها بستگی دارد. بنابراین، اگر حجمهای شستشوی پروتئین های با جرم شناخته شده را بر روی یک ستون فیلتراسیون ژل معین مشخص شود، می توان به راحتی جرم پروتئین داری جرم ناشناخته را با ترسیم نمودار وزن مولکولی در برابر حجم شستشو تعیین کنیم. این جرم، جرم پروتئین طبیعی است.
سومین کاربرد کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون در خالص سازی پروتئین است. از آنجا که این روش به جرم مولکولی بستگی دارد، ممکن است از آن برای جداسازی پروتئین ها بر اساس تفاوت در جرم آنها استفاده شود. یک محدودیت مهم در این روش ، حجم بارگیری نمونه ی اولیه است که حداکثر 5٪ از حجم بستر ستون است. بنابراین این روش اغلب در مراحل انتهایی یک استراتژی خالص سازی استفاده می شود.
کروماتوگرافی فاز معکوس (Reverse Phase chromatography)
علاوه بر دارا بودن جرم مشخص، شکل و بار سطحی ، همچنین مولکول های زیستی ممکن است از نظر آبگریزی با یکدیگر متفاوت باشند. حتی پروتئین های محلول نیز غالباً مناطقی از ساختارشان نسبتاً آبگریز است. این مناطق که به ساختار اولیه پروتئین بستگی دارند، برای جداسازی پروتئین ها یا پپتیدهای بسیار مشابه قابل استفاده است. اگر گروه های آبگریز مانند زنجیره های هیدروکربن را روی یک فاز ثابت تثبیت کنیم ، ممکن است قسمت های آبگریز موجود در ساختار پروتئین ها یا پپتیدها به این زنجیرها متصل شوند که اساس کروماتوگرافی فاز معکوس است. در این نوع کروماتوگرافی تفکیکی، فاز ثابت با استفاده از طول زنجیره هیدروکربن استفاده شده طراحی می شود (به عنوان مثال C-4 ، C-8 ، C-18). به طور کلی، از زنجیرهای با طول کوتاه تر برای کروماتوگرافی پروتئین ها استفاده می شود در حالی که زنجیرهای طولانی تر به دلیل آبگریزی نسبی بیشتر برای پپتیدها مناسب ترند.
به طور خاص ، شرایط لازم برای کروماتوگرافی پروتئین ها اغلب منجر به دناتوره شدن آنها می شود. بر این اساس ، کروماتوگرافی فاز معکوس کاربردهای زیادی در آنالیز پروتئین ها دارد اما برای خالص سازی پروتئین های فعال کاربرد چندانی ندارد.
کروماتوگرافی فاز نرمال (Normal Phase Chromatography)
یک روش بسیار کم استفاده، کروماتوگرافی فاز نرمال است که در آن، فاز ثابت قطبی است (به عنوان مثال آلکیلامین به سیلیس پیوند داده شده) در حالی که فاز متحرک غیر قطبی است (به عنوان مثال هپتان) و مولکول ها، با ترتیبی معکوس در مقایسه با کروماتوگرافی فاز معکوس، در گرادیان افزایش قطبیت (مثلاً متانول) شسته می شوند. این روش به ویژه برای نمونه هایی با حلالیت کم در آب بسیار مفید است.
کروماتوگرافی میانکنش آبگریز (Hydrophobic Interaction Chromatography)
در حضور ترکیباتی که توانایی اتصال با آب در پوسته حلالیت پروتئین ها را دارند (به عنوان مثال (NH4)2SO4)، می توان گروههای آبگریز پروتئین ها را در معرض قرار داد و با استفاده از یک فاز ثابت آبگریز که توسط گروه های پیوند یافته اکتیل (octyl) (به شدت آب گریز) یا فنیل (آبگریز ضعیف تر) تهیه شده است، می توان میانکنش های آبگریز بین پروتئین و چنین فاز پیوندی را تقویت کرد. این اساس روش کروماتوگرافی میانکنش آبگریز است که نوعی کروماتوگرافی جذبی می باشد.
نمونه های پروتئین در ستونهای حاوی رزین های دارای گروه های اکتیل یا فنیل در حضور غلظت زیاد (تقریباً 2 مولار) از یک حلال بسیار قطبی مانند (NH4)2SO4 بارگیری می شود. در چنین حلالهایی، میانکنش های آبگریز به شدت بین پروتئین ها و فاز ثابت تقویت می شود. استفاده از شیب کاهش قطبیت حلال، (به عنوان مثال M 2-0 (NH4)2SO4 ) به تدریج میانکنش های آبگریز را مختل می کند، بنابراین پروتئین ها (با آبگریزی خالص متفاوت) را از یکدیگر جدا می کند.
کروماتوگرافی میل ترکیبی (Affinity chromatography)
اصل اساسی روش کروماتوگرافی میل ترکیبی تثبیت یک مولکول کوچک یا لیگاند افینیتی (affinity ligand) بر روی یک فاز ثابت و استفاده از نمونه حاوی بیومولکول برای خالص سازی در این فاز است. به دلیل ماهیت بسیار ویژه ی مولکول هدف، تنها مولکولی که باید خالص شود به فاز ثابت متصل شده و سایر مولکول ها از میان فاز ثابت آزادانه عبور می کنند. به دلیل ویژگی بالا، این نوع کروماتوگرافی بعنوان یکی از موثرترین روش های خالص سازی پروتئین ها در نظر گرفته می شود. برخلاف بسیاری از تکنیک های دیگر کروماتوگرافی که تاکنون شرح داده شده است ، لازم است برای خالص سازی هر پروتئین ویژه یک فاز ثابت طراحی شود. جنبه مهم این روش از کروماتوگرافی ستونی، تثبیت لیگاند است. تکنیک های تثبیت از گروه های عاملی موجود در لیگاند مانند NH2– ، –SH ، –COOH و OH– بهره می برند. گروههای OH در فاز ثابت (معمولاً آگاروز) برای اینکه بتوانند از نظر شیمیایی واکنش نشان دهند ، نیاز به فعال سازی دارند. سپس لیگاند افینیتی بر روی رزین فعال تثبیت می شود.
برای شستن و جداسازی مولکولهایی که به طور ویژه متصل شده اند از تغییر pH یا قدرت یونی و یا ازمعرفهای شیمیایی مانند اوره استفاده می شود.
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC)
سینتیک جذب / دفع و عملکرد کروماتوگرافی در فازهای ثابت (رزین) دارای اندازه ی ذرات کوچکتر به طور قابل توجهی بهبود می یابد. در کروماتوگرافی ستونی مایع، ذرات فاز ثابت استفاده شده عمدتا از ژل های پلی ساکارید ساخته شده اند که از نظر مکانیکی ضعیف هستند. بنابراین ، حتی اگر چنین ذراتی با قطر کوچک تولید شوند، به اندازه کافی قوی نیستند تا در برابر فشارهای بالا برای دستیابی به کروماتوگرافی با عملکرد بالا مقاومت کنند. ضمن اینکه ذرات با قطر کوچکتر، چون مقاومت بیشتری در برابر جریان فاز متحرک دارند، منجر به کاهش بسیار زیاد جریان و ایجاد فشار برگشتی بر روی فاز ثابت می شوند که به نوبه خود می تواند باعث عدم تمرکز جدی باند و زمان ماندگاری طولانی به دلیل تغییر شکل بستر (فاز ثابت) شود.
ذرات مبتنی بر سیلیس (قطر 5-10 میکرومتر)، امکان استفاده از جریان های بالا را فراهم می کند که با پمپاژ فعال فاز متحرک از میان فاز ثابت تحت فشار بالا (تا MPa55) بدست می آیند. به این روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) می گویند. ترکیبی از فشار بالا با قطر ذرات کوچک، به تفکیک زیاد در این نوع کروماتوگرافی می انجامد.
نمونه از طریق یک سرنگ تزریق می شود که ممکن است به صورت دستی یا خودکار باشد. در بیشتر کروماتوگرافی های HPLC، فاز متحرک متشکل از مخلوطی از دو یا چند جزء (به عنوان مثال استونیتریل و آب) است که برای رسیدن به جداسازی سریع بر ستون اعمال می شود. فاز متحرک از طریق لوله های استیل ضد زنگ در فشار بالا در اطراف سیستم پمپ می شود. ستونی که فاز ثابت در آن فشرده (متراکم) شده است نیز از جنس استیل ضد زنگ است. ابعاد ستون های HPLC می تواند بسیار متفاوت باشد. یک ستون سنتی با قطر داخلی 2–5 میلی متر ممکن است دامنه سرعت جریان تقریباً 1–10 میلی لیتر در دقیقه داشته باشد. با این حال ، از ستون های ریزتر به طور فزاینده ای در جداسازی با وضوح بالا استفاده می شود.
کروماتوگرافی مایع پروتئین با سرعت بالا (Fast Protein Liquid Chromatography)
وضوح بالا و قابلیت کاربردی چشمگیر HPLC، آن را به روشی گسترده در بیوشیمی، شیمی تجزیه و شیمی آلی و بسیاری از زمینه های تحقیقی به ویژه در جداسازی و آنالیز مولکولهای زیستی با وزن مولکولی کم مانند واسطه های متابولیکی، واحدهای سازنده مولکول های زیستی و پپتیدها تبدیل کرده است. این روش معمولاً به آسانی قادر به خالص سازی مولکول های زیستی پیچیده مانند پروتئین ها در شکل فعال نیست. زیرا برخی از حالت های کروماتوگرافی که معمولاً در قالب HPLC انجام می شوند (به عنوان مثال کروماتوگرافی فاز معکوس) نیاز به استفاده از حلال های آلی دارند که پروتئین ها را تخریب می کنند. ثانیاً، اگرچه ستون های HPLC با ظرفیت زیاد در دسترس هستند، اما بسیار گران هستند و ستون های HPLC آنالتیکال با ظرفیت کم بسیار رایج ترند که این ستون ها محدودیت های شدیدی در مقدار بارگیری نمونه دارند (بسته به ستون حداکثر 200 میکروگرم).
کروماتوگرافی مایع پروتئین سریع (FPLC) یک روش ایده آل برای خالص سازی مولکول های زیستی فعال است. اگرچه این قالب کروماتوگرافی در ابتدا برای خالص سازی پروتئین ساخته شده است، اما تا کنون برای خالص سازی طیف گسترده ای از دیگر مولکولهای زیستی از جمله DNA (پلاسمیدها، قطعات محدود کننده (restriction fragments) و الیگونوکلئوتیدها)، مشتقات نوکلئوتیدی (به عنوان مثال NAD ، ATP)، کربوهیدرات ها و همچنین پپتیدها و دیگر مولکول های زیستی با وزن مولکولی کم مورد استفاده قرا گرفته است.
مطالعه بیشتر:
Erich Heftmann. Chromatography: A laboratory handbook of chromatographic and electrophoretic methods. 3rd edition, Van Nostrand Reinhold, 1975.
David Sheehan. PHYSICAL BIOCHEMISTRY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS. 2nd ed. John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, UK, 2009.