کروماتوگرافی تبادل یونی (Ion Exchange Chromatography)
پروتئین ها دارای بار خالصی در سطح خود هستند که بطور عمده ناشی از یونیزاسیون گروه های اسید و بازی زنجیره جانبی اسیدهای آمینه است که در pH معین، برخی از آنها با توجه به pK شان دارای بار مثبت یا منفی هستند.
در pH 7.0 اسیدهای آمینه اسیدی (اسیدهای آمینهی گلوتامیک و آسپارتیک) دارای بار منفی می شوند در مقابل باقیمانده اسیدهای آمینه بازی (لیزین و آرژنین) بار مثبت دارند. بنابراین اکثر پروتئین ها در pH اسیدی (پایین تر از 7) دارای بار خالص مثبت و در pH قلیایی (بالاتر از 7) دارای بار خالص منفی هستند. بار خالص در پروتئین ها ناشی از جمع جبری بار تمامی اسیدهای آمینه موجود در پروتئین است. بارهای مثبت و منفی می توانند یکدیگر را خنثی کنند، بنابراین، در یک مقدار pH خاص، پروتئین ممکن است دارای بار خالص صفر باشد حتی اگر حاوی برخی از بارهای مثبت و منفی باشد.
pH ی را که پروتئین در آن بار خالص صفر دارد، نقطه ایزوالکتریک (pI) پروتئین نامیده می شود. از آنجا که توالی اسید آمینه ای هر پروتئینی منحصر بفرد است و بار سطحی، ساختار و pI پروتئین ها به توالی اسید آمینه آنها بستگی دارد، بنابراین ممکن است اختلاف در بار خالص پروتئین ها به عنوان یک ویژگی فیزیکی مشخص برای جداسازی آنها از یکدیگر استفاده شود.
کروماتوگرافی تبادل یونی یا کروماتوگرافی یونی با نام های متداول و اختصاری IEC و IC ، نوعی کروماتوگرافی جذبی است که در آن پروتئین ها یا سایر مولکول های زیستی دارای بار الکتریکی خالص غیر صفر با یون های کوچک با بار مشابه مانند نمک ها مبادله می شوند (به عنوان مثال Na+، −Cl).
نحوه عمل کروماتوگرافی تبادل یونی نیز مثل سایر روش های کروماتوگرافی می باشد. بدین صورت که اجزای فاز متحرک که معمولا محلول بوده و حاوی نمونه ی دارای اجزای قابل یونیزه است، بر روی ستونی که دارای بستر ی از فاز جامد که حاوی گروه های باردار است، بارگیری شده و حرکت می کند. در این روش بین دو فاز ساکن جامد و متحرک مایع به صورت تعادلی و برگشت پذیر، تبادل و تعویض یون انجام می گیرد. این یونها به ساختارهای شیمیایی سطح فاز ثابت متصل هستند که گروههای تبادل یونی یا تعویض کننده های یونی نامیده می شوند. دو نوع تعویض کننده یونی رایج عبارتند از تعویض کننده های آنیونی (که یونها یا آنیونهای با بار منفی تبادل می کنند) و تعویض کننده های کاتیونی (که کاتیونهای با بار مثبت تبادل می کنند). توجه به این نکته مهم است که این فرایند تبادل یون مستقل از جرم، شکل یا سایر خصوصیات فیزیکی مولکولی اجزای دارای بار الکتریکی است که جدا می شوند. بنابراین ممکن است پروتئین هایی که دارای ویژگی های بسیار متفاوتی در ساختار اولیه، فعالیت زیستی، جرم، شکل و … هستند، به طور تصادفی رفتار یکسانی را در کروماتوگرافی تبادل یونی از خود نشان دهند. در مقابل، ایزوآنزیم ها (آنزیم هایی که از نظر ساختار اولیه و فعالیت بیولوژیکی ممکن است بسیار شبیه باشند) ممکن است رفتارهای بسیار متفاوتی در کروماتوگرافی تبادل یونی داشته باشند.
تعویض کننده های یونی به طیف گسترده ای از بسترهای جامد مانند سلولز ، آگارز و وینیل بنزن متصل هستند. خصوصیات فیزیکی فاز ثابت به عنوان یک مجموعه (تعویض کننده یونی به علاوه بستر جامد) قدرت تفکیک بالا یا پایین کروماتوگرافی تبادل یونی را تعیین خواهد کرد. تعویض کننده های یونی ضعیف در یک محدوده نسبتاً باریک از pH بهترین عملکرد را دارند، در حالی که تعویض کننده های یونی قوی در محدوده ی pH وسیع تری عملکرد خوبی دارند. تعویض کننده های یونی Quaternary amine و Methyl sulfonate به ترتیب به عنوان تعویض کننده های آنیونی و کاتیونی قوی شناخته می شوند، در حالی که تعویض کننده های یونی Diethylaminoethyl و Carboxymethyl به ترتیب تعویض کننده های آنیونی و کاتیونی ضعیف هستند. بار در تعویض کننده های آنیونی و کاتیونی ضعیف تحت تاثیر pH فاز متحرک است ولی تعویض کننده های یونی قوی این گونه نیستند.
انتخاب فاز ثابت تبادل یونی به شدت تحت تأثیر pI پروتئین های جدا شونده است. زمانی که هدف خالص سازی پروتئین های اسیدی است از فاز ثابت تبادل یونی که حاوی تعویض کننده های آنیونی هستند، استفاده می شود. ولی زمانی که هدف خالص سازی پروتئین های بازی است، از فاز ثابت تبادل یونی که حاوی تعویض کننده های کاتیونی هستند، استفاده می شود. در یک آزمایش کروماتوگرافی تبادل یونی، نمونه بر یک فاز ثابت که با یون مورد تبادل شارژ شده است، اعمال می شود (به عنوان مثال –Cl). پروتئین (و هر گونه دیگر از بارهای مشابه در نمونه) با یون (به عنوان مثال –Cl) تعویض و به تعویض کننده یونی متصل می شود. این مسأله مهم است که نمونه فاقد اجزای دارای بار مشابه با پروتئین جدا شونده باشد، زیرا معمولاً غلظت مولار این مواد نسبت به غلظت مولار پروتئین در نمونه بیشتر است و تعویض کننده یونی بین پروتئین های دارای یک بار مثبت و آنها در نمونه، تفاوتی قائل نخواهد شد. بنابراین در بسیاری موارد قبل از کروماتوگرافی تبادل یونی نمک زدایی از نمونه ضروری است. نمک زدایی از نمونه توسط کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون، دیالیز یا فیلتراسیون گریز از مرکز (centrifugal filtration) انجام می شود. شستشوی پروتئین های متصل شده به فاز ثابت با معکوس کردن فرآیند اتصال و مبادله دوباره آنها با یون ها حاصل می شود. این کار معمولاً با استفاده از مقدار زیادی نمک (به عنوان مثال NaCl) در فاز متحرک انجام می شود. از آنجا که بار خالص پروتئین ها متفاوت است، ممکن است پروتئین ها در pH معینی با قدرت های مختلف به یک تعویض کننده یونی متصل شوند، یعنی برخی از پروتئین ها ممکن است به شدت متصل شوند در حالی که سایر پروتئین ها ضعیف متصل شوند و برخی نیز بدون اتصال به فاز ثابت از ستون خارج می شوند. بنابراین می توان با استفاده از نمک در یک شیب پیوسته، از این مزیت برای جدا کردن پروتئین های متصل شده به فاز ثابت استفاده کرد. با استفاده از چنین روشی، پروتئین هایی که ضعیف متصل شده اند، ابتدا و در غلظت های پایین نمک از فاز ثابت جدا و شسته می شوند در حالی که پروتئین های محکم متصل شده در ادامه و با افزایش غلظت نمک به ترتیب شدت نیروی اتصال شان از فاز ثابت جدا و شسته می شوند.
با توجه به اختلاف در pK اسید های آمینه موجود در پروتئین ها، آنها در بیشتر مقادیر pH مقداری بار دارند (بار خالص آنها فقط در pH مربوط به pI صفر است). بنابراین با تغییر pH می توان بار خالص موجود در سطح آنها را به طور انتخابی تغییر داد. ممکن است دو پروتئین مختلف در یک pH معین بار خالص یکسانی داشته باشند، اما بعید به نظر می رسد که در تمام مقادیر pH دارای بار خالص یکسانی باشند. بنابراین، با انجام جداسازی در طیف وسیعی از pH، به کمک کروماتوگرافی می توان پروتئین ها را در یک pH واحد جدا کرد. در کاوش رفتار کروماتوگرافی پروتئین ها در طیف وسیعی از مقادیر pH باید در نظر داشت که بسیاری از پروتئین ها از نظر ساختاری در pH های بسیار بالا یا بسیار پایین (نامتعارف) ناپایدار هستند. این ممکن است باعث رسوب آنها در بستر فاز ثابت شود و همچنین ممکن است منجر به از دست رفتن فعالیت زیستی پروتئین خالص شده گردد. بنابراین بهتر است قبل از کروماتوگرافی تبادل یونی، آزمایشات اولیه ای برای تعیین پایداری pH و حلالیت پروتئین خالص انجام شود.
علاوه بر دستیابی به جداسازی پروتئین های کاملاً فعال در شرایط طبیعی با کروماتوگرافی تبادل یونی، انجام آزمایش در شرایط دناتوراسیون نیز امکان پذیر است. به عنوان مثال، پپتیدهای حاصل از هضم شیمیایی یا آنزیمی پروتئین ها را می توان در حضور اوره 4-7 مولار جدا نمود. هنگامی که کرومتوگرافی تعویض یون در حضور اوره انجام می شود، زیر واحد ها و پپتیدها دیگر با اینترکشن هایی مانند پل های نمکی و پیوندهای هیدروژن به یکدیگر متصل نخواهند شد. اوره گرچه یک مولکول قطبی است، ولی دارای بار خالص صفر است بنابراین خود با تعویض کننده یونی برهمکنش نخواهد داشت.
مطالعه بیشتر:
Erich Heftmann. Chromatography: A laboratory handbook of chromatographic and electrophoretic methods. 3rd edition, Van Nostrand Reinhold, 1975.
David Sheehan. PHYSICAL BIOCHEMISTRY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS. 2nd ed. John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, UK, 2009.